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      云序客戶再發高分文章,教你如何玩轉tRNA機制研究
      日期:2019年05月20日    來源:
      文章導讀:
      “忽如一夜春風來,千樹萬樹梨花開!”自然界的花花草草在悄無聲息的感受著大自然的變化。隨著全球氣候的變化,環境溫度也在不斷的變化,那么什么是溫度感受器?AET1是tRNA上鳥苷轉移酶,它是水稻高溫條件下正常生長所必需的。本文研究結果表明,tRNAHis鳥苷轉移酶AET1在植物應對高溫環境中發揮著重要作用。



      發表期刊:MOLECULAR PLANT
      影響因子:13.164
      實驗方法:
      tRNA測序RIPRIP qPCRRNA pull down
      文章內容:
      1. AET1突變水稻熱敏性
      AET1突變水稻在高溫環境下生長時主要呈矮小株,葉片狹窄卷曲,無法產生種子,相反在相對溫和環境下生長時沒有展現其他異常性狀。AET1基因的ORF區第1144個SNP(C突變為T)會引起第382個氨基酸從脯氨酸改變為絲氨酸。預測AET1基因編碼tRNA鳥苷轉移酶,多物種比對結果顯示AET1基因在包含哺乳動物在內的多種真核生物當中都是高度保守的,而第382個氨基酸在大部分雙子葉和單子葉植物中也是高度保守的。遺傳互補分析(genetic complementation test)顯示互補品系以及過表達水稻株都能夠有效的逆轉高溫下AET1突變所造成的異常形狀。CRISPR/Cas9的基因編輯水稻株也可以造成明顯的生長缺陷。控制變量實驗表明溫度是造成這一現象的環境因素,并且AET1基因是水稻對非生物因素敏感的主要原因。進一步觀察可以看到的是,盡管野生型和AET1突變水稻幼苗們沒有明顯的形態學改變,但是超微結構已經有巨大的改變,表明AET1基因對于高溫條件下細胞的增值是必不可少的。形態學觀察和表型實驗都說明AET1在水稻的生長、發育過程中對高溫的應答過程種起到重要作用。


      圖1. AET1突變體是熱敏性的
      2.AET1對tRNAHis成熟和tRNA表達穩態起重要作用
      體外酶活實驗證明AET1編碼的AET1His可以結合到pre-tRNA(tRNAHis前體)并在pre-tRNAHis 5’端添加鳥嘌呤,然而發生了突變的AET1P382S沒有該功能,表明被突變的382位的脯氨酸對于tRNA的鳥嘌呤轉移酶活性是必不可少的。
      tRNA測序(云序生物提供)結果表明,野生型和AET1突變型水稻株在正常和高溫條件下成熟tRNA的表達水平改變。測序結果表明,正常溫度下AET1突變體和野生型當中的tRNA異形體(isotype)含量相差不大,但是在高溫條件下AET1突變體當中的含量要明顯的高于野生型水稻株,并且高溫條件下頭部5’帶有鳥嘌呤的tRNA在AET1突變體當中有明顯的下降,這些現象都說明常溫下,AET1基因的酶活性在AET1突變體當中沒有太大改變,但高溫下酶功能會明顯喪失。tRNA測序分析可以看到其他類型的tRNA,比如tRNAMet,在AET1突變株當中的tRNAMet有明顯減少,由于tRNAMet和蛋白的翻譯效率相關,所以推測在高溫條件下AET1敲除水稻株的發育缺陷很有可能是因為蛋白翻譯效率低下造成。AET1基因對于tRNA豐度的維持必不可少,AET1的突變足以改變tRNA表達譜,在高溫環境下,AET1介導的tRNA修飾可以改變多個和蛋白翻譯效率相關的tRNA的表達水平。

      圖2. AET1突變在體外消除了AET1的活性,并破壞了體內tRNA表達譜
      3.AET1、RACK1A、eIF3h在內質網上的相互作用
      酵母雙雜交實驗說明兩個和核糖體相關的蛋白RACK1A以及eIF3h都和AET1相互作用。
      RNA pull down(云序生物可提供)也證明了AET1與RACK1A以及eIF3h結合。通過GST標簽的RACK1A蛋白也能夠富集MBP融合eIF3H。這些結果都能夠進一步證明AET1、RACK1A以及eIF3h三個蛋白能相互結合。生物分子熒光互補實驗證明RACK1A、eIF3h以及AET1三者能持續相互作用,這些結果都證明三個蛋白在體內能直接相互作用。融合蛋白的熒光信號顯示,蛋白的熒光信號和ER(內質網)標志蛋白重疊,暗示三者之間的相互作用發生在內置網上與核糖體相關。GUS染色,qRT-PCR分析AET1,RACK1A以及eIF3h三個基因的mRNA表達量,三個基因在組織當中具有表達,證明三個蛋白相互作用和蛋白合成相關。
          
      圖3. AET1與ER中RACK1A和eIF3h相互作用
      4.AET1而不是RACK1A以及eIF3h直接和OsARF mRNA結合
      AET1與RACK1A以及eIF3h的結合是否和mRNA相關?
      RIP測序(云序生物提供)幫助研究者快速的明確哪些mRNA能夠和蛋白AET1結合,分析結果顯示高溫條件下545個mRNA分子只在野生型水稻株當中和AET1結合,而僅僅208個mRNA分子只在AET1突變植物當中和AET1蛋白結合,50個基因的mRNA分子在兩個樣本當中均發生結合。KEGG結果顯示高溫條件下野生型水稻株當中和AET1結合的mRNA的來源基因往往和光合作用以及代謝過程相關,而高溫條件下只在AET1突變株當中結合的mRNA往往和氨基酸代謝通路相關。這些結果均顯示AET1的功能喪失可以通過tRNA的表達分布的失衡從而影響蛋白的合成。比較有趣的是,熱圖提示高溫條件下和植物生長素(auxin)相關的基因在野生型和突變型當中有明顯的改變,OsARF基因發生了明顯富集,暗示AET1基因可能是通過改變植物生長素信號通路來應對高溫產生應答反應。
      對RIP-seq結果進行進一步驗證,
      RIP qPCR(云序生物可提供)結果顯示OsARF19基因的上游開放閱讀框(uORF)和下游主要開放閱讀框(mORF)被明顯富集,高溫條件下的野生型和AET1突變型這兩者的富集程度有所區別。之前的報道顯示擬南芥當中,許多OsARF mRNA包含可以依賴eIF3h而抑 制翻譯的uORFs,作者推測在OsARFs基因當中的uORFs對mORFs的抑 制作用也存在,通過預測,RIP-qPCR的進一步驗證表明OsARF23 mRNA含有獨特的“start-stop”uORF結構,AET1能夠在高溫環境下通過OsARF mRNA來調控auxin信號通路。結果證明,是AET1,而不是RACK1A或者eIF3h結合OsARF mRNA來調控OsARF mRNA的翻譯過程。

      圖4. AET1與生長素響應因子的mRNA結合
      5.AET1和RACK1A以及eIF3h共同調控OsARF mRNA的翻譯效率
      高溫條件下OsARF19和OsARF23翻譯效率均下降,通過CRISPR/Cas9對RACK1A eIF3h基因進行突變發現,相關基因有明顯下降,植物的生長出現明顯的缺陷,比如高度下降、種子產率低等等問題。AET1、eIF3h、RACK1A蛋白表達水平和mRNA轉錄水平保持一致,結果表明AET1蛋白可以明顯的降低OsARF23蛋白的翻譯效率,同時RACK1A以及eIF3h的敲除均能夠引起OsARF23的表達下降。AET1突變水稻株對于外源性的auxin并不敏感,并且AET1基因使水稻對于高溫有更好的適應能力。

         
      圖5. AET1與RACK1A和eIF3h一起調節OsARF mRNA的翻譯效率

      總結:
      植物是無梗生物,因此進化出許多適應環境溫度變化的策略。在本研究中,作者發現了一種名為AET1的鳥苷酰轉移酶,它可以結合ER(內質網)中的RACK1A和elF3h蛋白,并與OsARF mRNAs緊密結合,從而調控相應的蛋白的翻譯,使水稻對于高溫有更好的適應能力。
       
      全文鏈接:
      https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1674205219301625

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