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      云序客戶Nat Com重磅成果丨miR-27a在結核病中機制研究新發現
      日期:2019年06月20日    來源:云序生物
      文章導讀
      結核病(TB,Tuberculosis)是結核桿菌(Mtb,Mycobacterium tuberculosis)感 染導致的疾病。根據感 染部位不同分為肺結核、淋巴結核、骨骼結核等,這是一種發病率較高、傳染性較強的疾病。據世界衛生組織統計,2016年全球范圍內有1040萬新病例并且有170萬死亡。

      云序客戶同濟大學醫學院、附屬上海市肺科醫院戈寶學教授實驗室長期從事圍繞肺結核預防和診治開展基礎和臨床轉化醫學研究,通過在我司做的miRNA測序不久前發表文章報道了新結核病的易感基因,為結核病的診斷和治 療提供了新的理論基礎。

      發表期刊:Nature Communications
      影響因子:14.919
      實驗方法:miRNA測序

      文章內容
      1. Mtb誘導miR-27a表達
      為探索結核菌感 染發病新機制,作者分別對正常人和肺結核患者外周血、結核菌感 染的小鼠不同時間點的肺組織、巨噬細胞進行miRNA測序(云序提供此服務),分析結果發現結核菌感 染會明顯上調 miR-27a的表達。


      圖1. Mtb誘導miR-27a表達
      2.miR-27a通過抑 制細胞自噬促進Mtb在細胞內的存活
      那miR-27a的高表達對Mtb有什么作用呢?作者接下來分別用miR-27a-M(miR-27a的模擬物)和miR-27a-I(miR-27a的抑 制劑)處理感 染Mtb的巨噬細胞,然后在不同時間點進行菌落形成單位(CFU)的檢測,從而判斷Mtb在細胞內的存活情況。結果顯示miR-27a-M能明顯促進Mtb在細胞內的存活,相反miR-27a-I能明顯抑 制Mtb在細胞內的存活。
      前人研究表明,Mtb在細胞內的存活受自噬控制,而LC3-I向LC3-II的轉化與自噬體的形成有關,并且這種轉化是自噬的關鍵標志物。miR-27a的過表達明顯降低了LC3-II的量,而miR-27a的抑 制劑增加了LC3-II的量。為了進一步驗證miR-27a通過自噬對Mtb發揮作用,作者使用mRFPGFP染料,監測LC3標志物在細胞內自噬情況:黃色非自噬,紅色自噬。在感 染Mtb的巨噬細胞中,miR-27a-M明顯抑 制自噬體的形成,而miR-27a-I加速自噬體成熟。當巨噬細胞中miR-27a的基因缺失時,LC3-II和自噬體的量升高。以上證據都表明miR-27a通過抑 制細胞自噬的發生從而促進胞內Mtb的存活。

      圖2. miR-27a通過抑 制自噬促進Mtb在細胞內的存活
      3.miR-27a增強細胞對Mtb的易感性
      為了評估miR-27a在體內TB發病機制中的功能作用,作者分別用Mtb的 H37Rv菌株去感 染WT小鼠或miR-27a 缺失的小鼠,28天后檢測組織病理學損傷,結果發現在WT小鼠的肺組織中Mtb感 染強烈,但是miR-27a缺失的小鼠的肺中的Mtb感 染較少。
      通過調節miRNA的表達,從而促進宿主的先天防御是研發針對TB的新型治 療有前景的方式。為了研究miR-27a的抑 制是否可以轉化為宿主定向療法(HDT),作者使用miR-27a antagomir(miR-27a抑 制劑)在小鼠Mtb感 染模型中抑 制miR-27a并測試其治 療功效,結果證明了該抑 制劑對小鼠模型中Mtb感 染有治 療效果。

          
      圖3. miR-27a增強細胞對Mtb的易感性
      miR-27a抑 制劑對Mtb感 染有治 療效果

      4.miR-27a直接靶向于Cacna2d3
      miR-27a通過什么方式抑 制細胞自噬從而促進胞內Mtb的存活的呢?作者使用堿基互補配對的方法,發現一系列miR-27a的潛在靶標,作者選擇Cacna2d3(Cac3)進行下一步研究。Cacna2d3的3'-UTR中具有miR-27a的特異性結合位點,為了確認Cacna2d3是否是miR-27a的直接靶標,我們進行了Cacna2d3的野生型(WT)和突變型(mut)的熒光素酶實驗,發現miR-27a可以直接與Cacna2d3的3'-UTR結合從而抑 制Cacna2d3的表達。同樣的,在感 染Mtb的小鼠巨噬細胞和來自TB患者的PBMC中,Cacna2d3的mRNA水平也很低。隨后作者分別檢測miR-27a-M和miR-27a-I處理后的Cacna2d3表達量,同樣發現兩者之間存在負相關的關系。且在沉默miR-27a后,Cacna2d3表達量隨時間增加。以上證據都表明,miR-27a可以直接與Cacna2d3結合從而抑 制Cacna2d3的表達。

      圖4. miR-27a直接與Cacna2d3結合抑 制Cacna2d3的表達
      5.Cacna2d3通過促進細胞自噬降低Mtb在細胞內的存活
      為了研究Cacna2d3在Mtb感 染中的作用,作者進行了CFU分析,以了解其對巨噬細胞中Mtb在細胞內存活的影響。首先,作者在體外用siRNA沉默Cacna2d3,發現Mtb活力明顯增加。接著作者又進行了體內實驗,引入了Cacna2d3突變小鼠,同樣發現巨噬細胞中Mtb在細胞內存活增加。透射電子顯微鏡(TEM)分析顯示,與WT細胞相比,在缺失Cacna2d3的巨噬細胞中積累了相對更多的細菌。當用Mtb感 染時,缺失Cacna2d3的巨噬細胞中LC3-II的量同樣減少。共聚焦顯微鏡分析顯示,通過siRNA或PB抑 制對Cacna2d3的抑 制明顯降低了細胞自噬。這些結果表明Cacna2d3可能通過促進自噬從而降低Mtb在細胞內的存活率。


      圖5. Cacna2d3通過促進細胞自噬降低Mtb在細胞內的存活
      6.miR-27a通過Cacna2d3和Ca2 +調節Mtb在細胞內的存活率
      為了確定miR-27a是否通過靶向Cacna2d3來調節Mtb在細胞內存活,作者分別用miR-27a-M和miR-27a-I轉染WT和Cacna2d3缺失的巨噬細胞,然后用Mtb感 染24小時。結果發現miR-27a-M轉染后明顯增加了WT巨噬細胞中Mtb的細菌存活率,但對Cacna2d3缺失的巨噬細胞中Mtb細菌存活率無影響。同樣的,miR-27a-I?明顯降低WT巨噬細胞中Mtb的細菌存活率,但不明顯降低Cacna2d3缺失的巨噬細胞中Mtb細菌存活率。共聚焦顯微鏡分析顯示,miR-27a-M抑  制WT巨噬細胞中LC3斑點(自噬體特征)的形成,而miR-27a-I促進了WT巨噬細胞中LC3斑點的形成。同樣,它們對Cacna2d3缺失的巨噬細胞中LC3斑點形成的無明顯影響。這些結果表明miR-27a可能通過靶向Cacna2d3來抑  制自噬從而促進Mtb在細胞內的存活率。此外,作者針對miR-27a的另外兩個候選靶標Plk2和St6galnac3也做了相應的研究,發現它們也能增加miR-27a缺失后巨噬細胞中Mtb的細胞內存活率,這些結果表明miR-27a可以同時靶向多個轉錄物,對Mtb生存力有效累積效應。


      圖6. miR-27a通過Cacna2d3調節Mtb在細胞內的存活率

      接下來作者又檢查了miR-27a是否通過Ca2 +信號傳導調節Mtb在細胞內的存活率。轉染?miR-27a-M明顯抑 制Mtb誘導的Ca 2+流入,而轉染miR-27a-I?明顯增強Ca 2+流入。類似地,在對Mtb感 染的反應中,與WT巨噬細胞相比,miR-27a缺失的巨噬細胞能明顯增強Ca 2+流入。與WT巨噬細胞相比,用Ca2 +抑  制劑BPD預處理miR-27a缺失的巨噬細胞,Mtb存活率沒有降低。在用BPD預處理的miR-27a缺失的巨噬細胞中也未發現LC3斑點的形成有明顯增加。這些結果表明,miR-27a可能通過下調Ca2 +信號傳導促進Mtb的存活。

      為了研究miR-27a與Cacna2d3在體內的相關性,分別用Mtb感 染WT和Cacna2d3缺失的小鼠14天,然后每3天用一次NC resist neoplasia藥和miR-27a抑 制劑治 療14天。然后對感 染小鼠的肺進行H&E染色。發現miR-27 Aresist neoplasia藥治 療可減輕病理損害,抗酸染色和CFU分析顯示,Mtb感 染的WT小鼠肺內細菌滴度明顯降低,而Mtb感 染Cacna2d3缺失的小鼠則無明顯變化,提示miR-27a可能通過體內靶向Cacna2d3調節Mtb的存活。

      圖7. miR-27a通過Ca2 +信號傳導調節Mtb在細胞內的存活率

      總結
      為探索結核菌感 染發病新機制,戈寶學教授團隊通過對Mtb感 染的巨噬細胞、小鼠以及結核病人的樣本進行miRNA測序分析,發現結核菌感 染會明顯上調 miR-27a的表達。miR-27a能明顯抑 制細胞自噬的發生從而促進胞內結核菌的存活并加重結核菌感 染發病。進一步的研究發現,miR-27a靶向內質網表面的離子通道Cacna2d3 并抑 制了Cacna2d3基因的表達,從而損壞了宿主細胞鈣信號通路和細胞自噬途徑以促進了結核菌的存活和感 染發病。miR-27a的抑 制劑的使用能夠有效地減輕結核分枝桿菌感 染引起的肺部病理損傷,以及降低肺部荷菌量。該研究不僅揭示了結核菌通過誘導宿主細胞的miRNA 來抑 制鈣信號介導的自噬的免疫逃避新途徑從而為結核病的診斷和治 療提供新的理論基礎,同時,miR-27a的抑 制劑作為一種新型的抗結核藥物已經在開發研究中。
       
      通訊作者簡介
      本文通訊作者是同濟大學醫學院附屬上海市肺科醫院戈寶學教授。戈寶學教授于1999年獲美國加州大學遺傳學博士學位。1999-2002年期間,在美國SCRIPPS研究所作博士后,2002年獲中科院百人計劃引進到中科院上海生科院任課題組長,2011年起任同濟大學特聘教授,博導,醫學院院長助理,上海市結核病(肺)重點實驗室主任,同濟大學附屬上海市肺科醫院轉化醫學研究中心主任,973項目首席科學家。先后獲得基金委杰出青年基金,第 一屆談家楨生命科學創新獎,教育部長江學者特聘教授。
      戈教授主要研究感 染免疫中的信號轉導調控機制,在Science、 Nature Immunology,、Cell Host & Microbe、 PLOS Pathogens,、JI,、JBC,、Cellular Signaling 等國際雜志上發表研究論文四十多篇。目前擔任法國MICROBES & INFECTION 雜志編委。上海市肺科醫院研究實習員劉峰博士,轉化醫學中心助理研究員陳建霞以及結核科主治醫師王鵬為該論文的共同第 一作者。在戈寶學教授的帶領下,該實驗室長期從事圍繞肺結核預防和診治開展基礎和臨床轉化醫學研究。

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