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      云序客戶揭秘m6A調控胃ai細胞EMT過程再次沖擊10分文章!
      日期:2019年12月27日    來源:云序生物

      文章導讀

      2018年云序客戶上海交通大學醫學院余健秀老師課題組在著 名雜志《核酸研究》(Nucleic Acid Research)上發表文章討論METTL3甲基化酶SUMO化對酶功能的影響,這篇優 秀文章的發表也正式標志云序生物正式走入了表觀轉錄組方向的科研助力時代。如今再傳捷報!云序客戶交大附屬仁濟醫院胃腸外科趙剛老師課題組在胃ai上皮細胞間充質轉化(EMT)過程中揭示RNA m6A修飾的調控作用,相關研究發表于著 名雜志 Molecular Cancer,這標志著云序生物高質量RNA甲基化服務來到全盛時代!

      不僅做譜,也有機制!繼解析了云序客戶兩例甲基化譜的案例(案例一/案例二),教您如何使用甲基化數據快速發表5分文章,本周帶來的重量級文章為大家分享如何做m6A甲基化機制研究。

      原文鏈接:METTL3-mediated N6-methyladenosine modification is critical for epithelialmesenchymal transition and metastasis of gastric cancer

      發表期刊:Molecular Cancer
      發表日期:20191013
      影響因子:27.401
      實驗方法:m6A-MeRIP-seqRNA-seqMeRIP-qPCRCo-IP(云序生物提供以上服務)

      Molecular Cancer

      上皮間充質轉換(EMT)過程是多種ai癥細胞發生轉移的重要特征,胃ai也不例外。發生EMT時,胃ai細胞逐步減少E-cadherin等細胞黏附蛋白的同時表達大量如N-cadherin、Vimentin等間充質標志蛋白。EMT和較差的臨床預后緊密相關,所以理解EMT過程對于任何一種ai癥的治 療都具有重要意義。之前的研究已經表明RNA甲基化修飾m6A在ai癥發生 發展中有調控作用,m6A甲基化酶(METTL3/METTL14/WTAP)、m6A去甲基化酶(FTO/ALKBH5)在多種疾病當中作用已經被證實,而本篇文章的結論是,METTL3是胃ai細胞EMT以及轉移過程的重要促進因子,通過下游重要靶點基因METTL3對胃ai細胞的轉移具有重要調控作用。

      Molecular Cancer


      文章內容

      1.METTL3的臨床相關性

      TCGA數據庫中胃ai數據的搜索結果顯示METTL3在胃ai組織中高表達且與較差的臨床預后相關,這一趨勢在對60例病人的qPCR驗證結果中保持一致,且METTL3的表達量與分期分級呈一定相關性。重要的是,METTL3在彌散型胃ai(diffuse-type GC)樣本中的表達量要高于腸型(intestinal-type GC)樣本。整體水平的甲基化顯示,胃ai樣本中mRNA的m6A修飾水平要高于對照樣本。免疫組化結果顯示METTL3主要分布于細胞核。KM曲線、單因素、多因素等分析都說明METT3是一個胃ai重要的臨床預后相關因子,在GC樣本中高表達,并與GC的發生 發展相關。


      METTL3高表達與臨床相關性

      圖1  METTL3高表達與臨床相關性

      2.METTL3是EMT過程必不可少的

      免疫組化染色結果提示METTL3和N-cadherin、Vimentin表達呈正相關,與E-cadherin呈負相關。對AGS細胞系的相關檢測表明,METTL3和EMT表型、間充質標志物的重要marker蛋白呈正相關。 過表達、敲除實驗都能伴隨著N-cadherin、Vimentin以及E-cadherin的相關性變化的同時,也能引起GC細胞整體水平m6A的變化。這些結果都表明METTL3實質上能夠促進GC細胞的EMT過程發生 發展。

      METTL3的干預可以改變EMT相關marker的改變

      圖2 METTL3的干預可以改變EMT相關marker的改變

      3.體內體外實驗證明METTL3促進細胞侵襲與轉移

      METTL3介導的EMT過程是否能引起GC細胞的轉移?劃痕實驗與transwell實驗證明METTL3表達的下調能夠明顯的阻礙BGC823細胞的遷移能力與侵襲能力,而上調能夠明顯增強MKN-28細胞的轉移能力與異位表達。尾靜脈注射的裸鼠在體實驗證明BGC823-shRNA細胞的轉移能力要明顯弱于對照細胞,反之亦然。無論體內體外實驗都說明METTL3可以增強胃ai細胞的侵襲和轉移能力。

      體內體外證明METTL3具有增強轉移、侵襲能力

      圖4 體內體外證明METTL3具有增強轉移、侵襲能力

      4. RNA-seq&m6A MeRIP-seq發現ZMYM1是METTL3的重要靶點

      Mettl3的強大功能在之前的結果當中已經被證實,但是它的靶點分子有哪些?RNA-seq轉錄組測序首先明確在METTL3敲除以后哪些基因發生了差異性表達,測序結果顯示798個基因顯 著下調,662個基因顯 著上調。相同背景的樣本使用m6A MeRIP-seq甲基化測序發現9465和8794個m6A位點是組內特異的,GO分析發現差異甲基化的基因功能主要富集在半包橋小體組裝(hemidesmosome assembly)、中心體定位(centrosome localization)等功能,暗示m6A修飾可能會帶來染色體方面的影響。信號通路富集結果顯示多個腫 瘤相關的信號通路(腎ai、甲狀腺ai以及HIF信號通路)都被有效富集,m6A經典motif也有顯 著富集。 把850個甲基化水平下調的甲基化基因和798個下調的靶基因進行聯合分析把目標鎖定在其中13個基因,在這13個基因當中選擇帶有兩個甲基化修飾位點的ZMYM1作為下游靶標,這兩個甲基化修飾位點都存在于終止密碼子附近,在METTL3敲低以后甲基化水平都下調。目前,ZMYM1的生物學功能并不清楚,接下來需要做的工作就是搞清楚ZMYM1的功能以及甲基化的調控作用。

       差異甲基化和差異表達RNA的聯合分析

      圖5 差異甲基化和差異表達RNA的聯合分析

      5. ZYMY1與METTL3相關性探索

      無論在蛋白水平還是RNA水平,METTL3的敲除的可以顯 著下調ZMYM1的表達,而METTL3的過表達可以上調ZMYM1表達,實驗證明ZMYM1和METTL3呈正相關,METTL3正相關調控ZMYM1。

      METTL3和ZYMY1相關性分析

      圖5 METTL3和ZYMY1相關性分析

      6. METTL3通過依賴于HuR結合增強ZMYM1 mRNA穩定性

      MeRIP-qPCR首先用于對ZMYM1 mRNA甲基化區域的驗證。在確定了ZMYM1 mRNA的甲基化位點確實存在之后,通過METTL3的過表達或敲除之后能夠明顯改變該位點的甲基化水平,進一步說明該m6A位點受METTL3的調控。通過對ZMYM1甲基化位點的單堿基突變,過表達或者敲除METTL3對該甲基化位點的調控作用就消失了。由于HuR蛋白和METTL3一樣主要分布在細胞核當中,并且一直被認為是一個由METTL3募集的間接m6A Reader蛋白,作者選擇重點關注HuR和RNA分子之間的相互結合,HuR和ZYMY1的結合區域恰巧在m6A修飾位點附近,在ZMYM1發生去甲基化(沉默METTL3)以后,HuR和METTL3的結合大 大減弱,這一系列實驗證明METTL3對ZMYM1的影響是通過m6a修飾從而結合HuR蛋白來進行的。

      甲基化位點的堿基突變策略以及影響HuR蛋白相互結合

      圖6 甲基化位點的堿基突變策略以及影響HuR蛋白相互結合

      7. ZMYM1復合物在核內抑 制E-cadherin從而影響EMT過程

      由于鋅指蛋白結構有調控轉錄活性特性的特點,猜想ZMYM1同樣在細胞核內有調控轉錄活性的作用。實驗證明ZMYM1能夠通過MYM型鋅指結構同CtBP/L SD1/CoREST復合物結合,進而增強對靶基因的轉錄抑 制作用。免疫共沉淀Co-IP實驗證實了ZYMY1與CtBP/L SD1/CoREST復合物結合的存在形式。而這種復合物的存在可以有效的靶向抑 制E-cadherin的轉錄。直接對ZMYM1的過表達或者敲除實驗也證明ZMYM1能夠改變胃ai細胞的遷移與侵襲行為,METTL3正是通過調控m6A影響HuR蛋白結合的方式來改變METTL3的表達量,進而促進胃ai細胞的EMT過程。

      總結

      RNA甲基化作為當下生命科學的研究領域主題被廣 泛研究,在多種疾病當中均有顯 著調控作用,花樣繁多的作用方式可以從RNA分子核內轉錄到核外成熟從而影響其分子一生。這項研究成果讓讀者從新的角度來解釋甲基化對腫 瘤EMT的影響。2019年對于云序生物來說是豐收的一年,云序生物成熟的RNA甲基化測序服務平臺幫助多位客戶成功申請國自然,發表高 分文章。對于這個全新且火熱的領域,云序生物高通量產品已經成為廣大科研工作者的首 選,找差異,找位點,廣撒網,定方案。云序生物將再接再厲,助力多位客戶發表高 分文章,歡迎各位來電垂詢!

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      m6A MeRIP測序流程圖


      m6A MeRIP測序流程圖


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