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      1區,IF=16.8| 云序RNA乙酰化測序/acRIP-seq助力心梗機制研究!
      日期:2022年04月15日    來源:
      N4-乙酰胞苷(ac4C)是RNA修飾的一種,被發現是由N-乙酰轉移酶10(NAT10)催化的一種新的mRNA修飾,可增加mRNA穩定性并提高其翻譯效率。近期,云序客戶青島大學王昆教授課題組在Advanced Science雜志(IF=16.8)上發表了文章PIWI-Interacting RNA HAAPIR Regulates Cardiomyocyte Death After Myocardial Infarction by Promoting NAT10-Mediated ac4C Acetylation of Tfec mRNA,發現了piRNA HAAPIR通過促進nat10介導的mRNA ac4c乙酰化來調節心肌梗死后的心肌細胞死亡。云序生物提供了其中RNA乙酰化測序/acRIP-seqRNA-seqChIP-seq服務。下面我們為大家介紹這篇文章的研究思路。

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      發表期刊:Advanced Science
      影響因子:16.806
      發表時間:2022年2月9日
      研究方法RNA乙酰化測序/acRIP-seqRNA-seqacRIP-qPCRChIP-seq
      文章鏈接PIWI-Interacting RNA HAAPIR Regulates Cardiomyocyte Death After Myocardial Infarction by Promoting NAT10-Mediated ac4C Acetylation of Tfec mRNA

      技術路線


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      研 究 內 容


       1、心臟缺血/再灌注相關piRNA(s)的鑒定和特征
      為了研究piRNAs與心肌細胞凋亡相關的功能,作者選擇了兩組:sham組與缺血/再灌注(IR)組小鼠心臟進行比較分析。與sham組相比,IR組存在19個piRNAs增加,5個piRNAs減少。
      并檢測了過氧化氫處理后,這些piRNAs在心肌細胞中的表達水平。其中,piRNA DQ542443表達水平顯著升高。這是一個在心肌中高表達的piRNA。因此,作者推測DQ542443在IR誘導的心臟損傷中具有潛在的調控作用,并選擇其進行進一步研究,并將其命名為HAAPIR,并證實HAAPIR在3‘端上包含2’-O-甲基化。熒光原位雜交(FISH)檢測結果顯示,HAAPIR同時分布于心肌細胞的細胞核和細胞質中。
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      2 、抑制HAAPIR可阻斷H2O2誘導的心肌細胞凋亡

      為了證實HAAPIR在調節心肌細胞凋亡中的作用,作者構建了體外H2O2誘導的細胞凋亡模型,發現用抑制劑敲除HAAPIR后,減弱了H2O2誘導的HAAPIR表達增加。HAAPIR敲低抑制了H2O2誘導的心肌細胞凋亡的增加。同時,作者還驗證了HAAPIR是否參與了心肌細胞線粒體裂變的調控,發現HAAPIR的下調抑制了H2O2誘導的線粒體碎片化的增加,HAAPIR的過表達會導致心肌細胞凋亡和線粒體碎片化。
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      3、HAAPIR缺失可改善I/R誘導的細胞凋亡和心肌損傷
      為了研究HAAPIR是否與心肌損傷相關及其在體內的功能作用,作者使用CRISPR/Cas9技術構建了HAAPIR敲除(HAAPIRKO)小鼠。通過測序和qPCR進行基因表達分析,證實了KO小鼠中HAAPIR的缺失。HAAPIRKO小鼠心臟沒有任何形態學或功能表型變化。與野生型相比,HAAPIRKO小鼠心臟的心肌細胞凋亡和線粒體碎片化顯著減少。此外,與I/R損傷的心臟相比,HAAPIRKO心臟的梗死面積減小和心室功能改善。綜上所述,HAAPIR缺失可阻斷心肌細胞凋亡,減輕I/R損傷引起的心肌功能障礙。

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      4、HAAPIR與NAT10結合,調節其ac4C乙酰化活性

      接下來,作者試圖研究HAAPIR調控心肌細胞凋亡的分子機制。作者進行了RNA pull down實驗,發現HAAPIR在心肌細胞中與NAT10結合,并通過RIP和qPCR驗證兩者在體內有直接相互作用。此外,HAAPIR的過表達或敲除并不影響心肌細胞中NAT10 mRNA和蛋白的表達水平。綜上所述,HAAPIR與NAT10相互作用,可能與ac4C乙酰化活性的調控有關。

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      5、HAAPIR基因敲除小鼠心臟中的ac4c乙酰化
      為了闡明HAAPIR調控n4-乙酰胞苷修飾的分子機制,作者在HAAPIRKO和WT小鼠心臟中進行了RNA乙酰化測序(acRIP-seq)。測序結果顯示,HAAPIRKO和WT小鼠心臟共有2139個共同的ac4C峰,占HAAPIRKO心臟總乙酰化峰的63.02%,在WT心臟中占51.62%。Ac4C多發生在mRNA中,大多數mRNA包含一個或兩個ac4C峰。對ac4C峰的序列分析顯示,U(A)UCCAGG和CAGCA(U)G(C)基序在ac4C位點內高度富集。Ac4C峰主要分布在編碼序列(CDSs)、近終止密碼子和3‘非翻譯區(3’UTRs)。GO分析顯示,ac4c修飾上調的基因主要參與心血管系統發育、正向調控信號轉導和細胞死亡;ac4C修飾下調的基因主要參與分子功能調控、細胞分化調控和細胞死亡。這些結果表明,具有ac4C修飾的基因與細胞功能或在心臟中的基因表達的調控。為了確定ac4C修飾與基因表達之間的關系,作者同時在HAAPIRKO和WT小鼠的心臟中進行了RNA-seq,將基因表達水平與ac4C修飾水平相關聯,篩選靶基因。
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      6、HAAPIR促進NAT10介導的ac4C修飾和Tfec mRNA的表達
      接下來,作者對一些被報道的與細胞凋亡相關的差異乙酰化基因和差異表達基因進行了acRIP-qPCR和qPCR檢測。其中,TFEC的ac4C修飾最低,在HAAPIRKO心臟中表達顯著降低。相比之下,在過表達HAAPIR的心肌細胞中,Tfec中ac4C的富集增加,Tfec mRNA和蛋白水平增加。基于以上結果,作者選擇Tfec作為ac4C調控心肌細胞凋亡的候選靶點,進一步研究。
      然后作者研究了HAAPIR如何上調Tfec的表達。在HAAPIRKO心臟中,NAT10與Tfec mRNA的結合顯著降低。此外,NAT10在心肌細胞中的強制表達增加了Tfec mRNA中的ac4C修飾,提高了Tfec蛋白水平,而這些作用在HAAPIR過表達時得到增強。這些結果表明,HAAPIR通過NAT10介導了Tfec mRNA中的ac4C修飾,而這種乙酰化修飾增強了其穩定性和翻譯能力。
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      7、抑制Tfec可減輕體內外心肌細胞的凋亡
      在心肌細胞中,Tfec的表達在過氧化氫刺激下有所增加,而Tfec的沉默阻斷了H2O2誘導的心肌細胞凋亡和線粒體碎片化。在體內,心肌I/R損傷后Tfec mRNA和蛋白水平升高,Tfec下調顯著降低了Tfec水平、心肌細胞凋亡和梗死面積。此外,Tfec的敲除抑制了H/R誘導的細胞凋亡,而不影響心肌細胞的壞死。此外,HAAPIR的下調減弱了H2O2誘導的Tfec表達的增加和細胞凋亡,而這些作用在NAT10過表達時減弱。結果表明,Tfec參與了心肌細胞凋亡的調控,而Tfec是HAAPIR和NAT10的直接下游分子。
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      8、Tfec在心肌細胞凋亡過程中調控Bik的表達
      為了探索Tfec的下游信號通路,作者進行了ChIP-seq,鑒定了數千個不同的TFEC結合染色質區域,使用這些TFEC結合區域發現的基序產生了一致的TFEC基序(CACGTG)。作者同時進行了RNA-seq,發現,過氧化氫處理的TFEC過表達心肌細胞中有694個上調差異表達和959個下調差異表達mRNA。在差異表達數據集中,與TFEC結合染色質區域和TFEC下游相關基因的交集包含376個基因。綜合與TFEC結合啟動子區域相關的基因和具有凋亡調控功能的基因篩選出了Bik——一種促凋亡蛋白。作者通過ChIP-qPCR驗證了TFEC與所鑒定的序列的結合,并證實了在TFEC過表達后,Bik啟動子區域比正常的IgG顯著富集。過表達Tfec顯著增加了H202誘導的Bik mRNA的表達,而敲除TFEC則降低了H202刺激的Bik表達的增加,表明轉錄因子TFEC刺激了Bik的表達。體內實驗驗證了這些結論。在心肌細胞中,HAAPIR增加了Bik蛋白水平和凋亡,而這些增加在TFEC敲低或NAT10敲低后被逆轉。
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      總  結
      該研究發現了一種心臟凋亡相關piRNA(HAAPIR),通過靶向N-乙酰轉移酶10(NAT10)介導的N4-乙酰胞苷(ac4C)轉錄因子EC(Tfec)mRNA轉錄物來調節心肌細胞凋亡。作者驗證了與野生型小鼠相比,HAAPIR缺失可減輕缺血/再灌注誘導的心肌梗死,改善心功能。在機制上,通過RNA pull downRIP實驗發現了HAAPIR直接與NAT10相互作用;通過RNA乙酰化測序/acRIP-seq結合RNA-seq篩選出受HAAPIR影響其乙酰化修飾和表達的靶基因TfecmRNA;通過細胞實驗及ChIP-seq驗證了TFEC可以進一步上調促凋亡因子Bik的積累,調控心肌細胞凋亡的進展。HAAPIR-NAT10-TFEC-BIK信號軸可能是減少缺血性心臟病中心肌細胞凋亡引起的心肌損傷的潛在靶點。

      云序生物ac4C修飾研究五大模塊

      01 ac4C RNA修飾測序
      ac4C RNA修飾測序
      對ac4C RNA乙酰化,目前最流行的檢測手段為acRIP-seq技術,適用于ac4C RNA乙酰化譜研究,快速篩選ac4C RNA乙酰化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序:
      • ac4C 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
      • ac4C  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
      • ac4C  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
      • ac4C  mRNA測序
      • ac4C  rRNA測序
      • ac4C  circRNA測序
      • ac4C  tRNA測序
      02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
      LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
      精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
      03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
      ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
      尋找上游直接調控ac4C RNA乙酰化的甲基轉移酶。
      04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
      acRIP-qPCR
      云序提供acRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
      05 機制互作研究
      RIP-seq/qPCR
      篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
      RNA pull down -MS/WB
      篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
      雙熒光素酶實驗
      驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
      ChIP-seq
      篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。

      --  云序生物服務優勢  --
      優勢一:發表10分以上文章最多的RNA修飾測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表71+篇高水平RNA修飾文章,合計影響因子570+,是國內支持發文最多、累計影響因子最高的公司。
      優勢二:至今完成4000+例RNA修飾高通量測序樣本,全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
      優勢三:全面檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
      優勢四:獨家提供ac4C一站式服務:ac4C整體水平檢測acRIP-seqacRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull down等。

      優勢五:率先研發微量acRIP測序技術,RNA量低至500ng起。

      優勢六:國內最全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化測序。

      云序客戶多種RNA修飾(m6A以外修飾)文章列表

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