1區，IF=7.561｜曹雪濤院士團隊揭秘2’-O-甲基化修飾對先天免疫及病毒感染的影響
日期：2022年05月20日 來源：
2’-O-CH3 修飾，即 2’-O-甲基化修飾，是一種常見于 tRNA、rRNA 和 snRNA 的 RNA 修飾類型。由于這種甲基化修飾（記作“m”）可以發生于 A/U/G/C （記作“N”）中的任何一種核苷酸殘基的核糖 2’-OH 上，即可能為 Am/Um/Gm/Cm 中的任意一種，故又被稱為“Nm 修飾”。Nm 修飾可增強核苷酸的疏水性，從而影響 RNA 分子的結構和穩定性，進而調節多種生物學過程。近年來，得益于高通量測序技術的普及，mRNA 上的 Nm 修飾現象也得到了逐步揭示。研究發現，mRNA 上的 Nm 修飾常出現于 5’ 帽子結構下游的第 1、2 位核苷酸殘基上，在 mRNA 的其它區域也有報道發現。然而，Nm 修飾對于免疫細胞的生理功能有何影響，仍然是一片未知的領域。近期，南開大學校長曹雪濤院士領銜的科研團隊發表的論文發現，Nm 甲基化轉移酶 FBL 可通過對 mRNA 的 Nm 修飾來促進病毒感染、抑制先天免疫反應。云序生物有幸參與了此項研究中的 2’-O-甲基化修飾測序（Nm-seq ）、mRNA 測序以及數據分析。至此，云序生物服務的客戶在RNA修飾研究上面即將實現大滿貫，在m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、 2’-O-甲基化修飾均發表高質量文章。
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論文標題：RNA 2’-O-Methyltransferase Fibrillarin Facilitates Virus Entry Into Macrophages Through Inhibiting Type I Interferon Response
發表期刊：Frontiers in Immunology (IF=7.561)
作者院校：南開大學 & 北京協和醫學院
研究方法：RNA 修飾質譜LC-MS、2’-O-甲基化修飾測序（Nm-seq ）、mRNA 測序
Nm 修飾示意圖
簡化版研究思路圖
1、病毒感染提升 mRNA 中 Am 修飾的整體水平
研究者首先在 VSV 病毒（Vesicular Stomatitis Virus）感染的小鼠巨噬細胞 RAW264.7 和未感染的對照組細胞中進行了mRNA 修飾質譜LC-MS，發現核糖 2’-OH 上發生甲基化修飾的腺嘌呤殘基（Am）的比例在病毒感染后顯著上升。研究者進而對 VSV 病毒感染的小鼠巨噬細胞及未感染病毒的對照組細胞進行了 mRNA 的 2’-O-甲基化修飾測序（Nm-seq ），發現了兩組細胞之間存在 6808 個差異 Nm 修飾位點（fold change >=4）。基于組間差異 Nm 修飾位點進行的 GO 分析顯示，分子功能（MF）差異主要集中于翻譯和 RNA 加工，細胞組分（CC）差異主要集中于外泌體、細胞核以及細胞質，生物功能（BP）差異主要集中于核苷酸結合和蛋白質結合等。基于組間差異 Nm 修飾位點進行的 KEGG pathway 分析顯示，差異 Nm 修飾基因主要富集于病毒感染相關的通路當中。Nm 修飾位點在基因內區域的統計顯示，大部分 Nm 位點位于編碼區（CDS）。研究者還對病毒感染組和對照組的 Nm 修飾 motif 進行了分析，發現 Nm 修飾 motif 在病毒感染前后存在差異，說明病毒感染前后可能造成了不同 RNA 分子的豐度改變。以上證據說明，mRNA 的 Nm 修飾可能參與調節病毒感染以及抗病毒免疫過程。
2、Nm 甲基化轉移酶 FBL 促進病毒感染
研究者對 8 種 Nm 甲基化轉移酶（FTSJ1、FTSJ2、FTSJ3、FBL、CMTR1、CMTR2、MRM1、MRM3）進行了 siRNA 敲降實驗的篩選，發現敲降 FBL 可以在 RNA 水平、蛋白質水平以及病毒滴度水平抑制 VSV 病毒對小鼠外周血巨噬細胞的感染。研究者通過查詢 GEO 數據庫發現，系統性紅斑狼瘡病人的 CD19+ B 細胞和 CD4+ T 細胞相比于健康對照組，FBL 的表達量顯著降低，暗示 FBL 可能具有免疫調節的功能。研究者還換用病毒物種以及宿主物種進行了一系列 FBL 敲降后的病毒感染實驗，結果均顯示 FBL 具有促進病毒感染的功能。
3、FBL 在感染早期促進 VSV 病毒進入巨噬細胞
Ⅰ 型干擾素（IFN-I） 和干擾素刺激基因（Interferon Stimulated Genes, ISGs）在抗病毒先天免疫中扮演重要的角色。然而，當發生 VSV 病毒感染時，在 FBL 敲降的小鼠外周血巨噬細胞中，相比于對照組的細胞，IFN- α、IFN- β 以及 IFN-I 信號通路中的其它分子卻并沒有顯著變化。研究者還發現，FBL 敲降也不影響小鼠外周血巨噬細胞的活性。不過，在 VSV 感染后 0h、4h、7h、10h 針對病毒感染相關蛋白分子的 Western Blot 實驗中發現，FBL 敲降可在病毒感染早期抑制 VSV 蛋白的表達。研究者因此進一步進行了 VSV 結合細胞以及進入細胞的檢測，發現 FBL 敲降并不影響 VSV 與細胞的結合，但會抑制 VSV 進入細胞。
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4 、FBL 在正常生理條件下抑制 ISGs 在巨噬細胞中的表達
研究者在基因編輯 FBL 敲除雜合子細胞系（Fbl+/-）和對照組細胞（Fbl+/+）做了mRNA 測序（3 vs 3），發現 FBL 敲除細胞中的多個干擾素刺激基因（Interferon Stimulated Genes, ISGs）的表達發生了上調。這種上調現象無需病毒感染作為刺激條件。針對 Ifi44、Oas2、Ifit3、Ddx60、Oasl1、Bst2、Ifit1 等幾個 ISGs 的 RT-qPCR 也發現，這些基因的 mRNA 在 FBL 敲降的細胞中表達水平發生上調。
因此，作者認為，FBL 在正常生理條件下扮演了免疫抑制劑的角色。當 FBL 被敲降時，一些抗病毒的免疫基因的表達增加，因此抑制 VSV 病毒進入巨噬細胞。
5 、敲降 FBL 可通過 IFN-I 信號通路提升 ISGs 表達，從而抑制病毒進入細胞
早先的研究顯示，IFN-I 可以通過 IFNAR-JAK-STAT 信號通路來誘導 ISGs 的表達。研究者發現，在 IFNAR 沉默的細胞系中，如果再敲降 FBL 的話，將無法提升 ISGs 的表達，也不能抑制 VSV 病毒進入細胞。并且，當人為引入充足的 IFN-β 刺激條件時，即使 FBL 敲降也不能提升 ISGs 的表達水平。綜上所述我們可以得出結論：FBL 是通過 IFN-I 信號通路來起到提升 ISGs 表達水平的作用的。
6 、FBL 介導的 RNA 2’-O-甲基化修飾抑制先天免疫系統的激活以及 IFN-I 的表達
研究者在基因編輯 FBL 敲除雜合子細胞系（Fbl+/-）和對照組細胞（Fbl+/+）中進行了 mRNA 修飾質譜LC-MS，發現 FBL 敲除細胞系中的 Am 修飾比例顯著下降。FBL 細胞中類似的 Nm 修飾比例下降現象也出現在總 RNA 的修飾質譜檢測（5 vs 5）結果當中，且可以被 FBl 過表達載體所逆轉。以上證據說明，FBL 催化了 Nm 修飾的發生。
據報道，mRNA 的 5’ 帽子結構上的 Nm 修飾可以用于區分內源 RNA 和外源 RNA：在靈長類細胞和小鼠細胞實驗中，缺乏 5’ 帽子結構 Nm 修飾的外源病毒 mRNA 可被細胞識別并弱化（attenuate）。因此，作者推測，在 FBL 敲降的巨噬細胞中，低 Nm 修飾的內源 RNA 可能被誤識別為外源 RNA，從而激活先天免疫系統 IFN-I 相關信號的表達。一系列 mRNA 和蛋白質定量檢測實驗結果都顯示，FBL 敲降的巨噬細胞中 IFN-β 以及抗病毒免疫信號通路的一些分子都發生了上調，印證了作者的猜想。
7、FBL 通過 MDA5 介導對 IFN-I 信號和 ISGs 的調控
MDA5 和 RIG-I 都是常見的病毒 RNA 識別分子。研究者分別構建了 MDA5 和 RIG-I 敲除細胞系，并在此基礎上進行 FBL 敲降實驗，檢測 ISGs 的 mRNA 表達水平以及 VSV 進入細胞后的 mRNA 表達水平。實驗結果發現，在 MDA5 敲除細胞系中，FBL 敲降處理將不會影響 ISGs 的表達，也不會影響 VSV 進入細胞，說明 FBL 作用于 MDA5 的上游。
小 結
綜上所述，作者發現 Nm 甲基化轉移酶 FBL 可催化包括 mRNA 在內的小鼠巨噬細胞 RNA 發生 Nm 修飾。這種 Nm 修飾水平可被 MDA5 識別檢測，如果 FBL 表達受抑制、 Nm 修飾水平降低，則會被 MDA5 解讀為外源 RNA 的信號，激活 IFN-I 相關信號，進而促進 ISGs 的表達，引發抗病毒的先天免疫反應。由于病毒感染可以抑制 FBL 的表達，因此最終可以反過來阻止更多病毒進入細胞。
-- 云序生物服務優勢 --
單堿基分辨
可對2’-O-甲基化修飾進行單堿基定位。
高通量檢測
可對全轉錄組范圍內的2’-O-甲基化修飾位點進行高通量地平行檢測。
全分子覆蓋
可全面地對mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多類RNA分子的2’-O-甲基化修飾位點進行檢測。
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比色法檢測整體RNA修飾水平
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03 RNA修飾上游酶的篩選
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04 RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
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