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      先收藏:2022年 eccDNA 研究現況匯總
      日期:2022年06月09日    來源:
      傳統上,環狀 DNA 被認為僅存在于原核生物以及部分病毒當中,在真核生物當中,僅有半自主細胞器線粒體和葉綠體當中具有環狀 DNA。1964年,伊利諾伊大學的 Yasuo Hotta 和 Alix Bassel 卻在小麥的胚和公豬精液當中發現了環狀 DNA,證明了這種看似結構怪異的 DNA 在高等植物和哺乳動物中亦存在。從 1960 年代至今的半個多世紀里,研究者已經在幾乎所有的物種當中發現環狀 DNA 的蹤跡。因為這些環狀 DNA 存在于染色體之外,因此也得名“染色體外環狀 DNA”( extrachromosomal circular DNA,簡稱 eccDNA) 。近年來,得益于分離純化以及測序技術的進步,eccDNA 領域的研究實現了爆炸式的增長。
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      eccDNA的大小
      在有些文獻當中,將較小的染色體外環狀DNA定義為狹義的 eccDNA,而將較大的染色體外環狀DNA定義為 ecDNA。這一分類方法是人為主觀分類,大多以10000bp長度為界限。此外,在早期的文獻當中,還存在“spcDNA ”(約 100 到 10000 bp)、“microDNA”( 約200 到 3000 bp)等名詞。在云序生物,我們采用 eccDNA 的廣義定義,即凡是位于染色體以外的環狀 DNA,均可稱為 eccDNA。
      大量文獻報道都發現,eccDNA 的大小長度分布,往往在核小體單位長度(180-200bp)的倍數附近成峰,且長度一般以一千以下的短環為主。這可能與細胞凋亡時產生的 DNA 核小體片段有關系。

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      孕婦血漿中的 eccDNA 長度分布

      圖出自“Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma”


      eccDNA的數目
      eccDNA 在各類物種、各類組織當中幾乎都可以檢測到。雖然在不同類型的樣品中存在一定的異質性,但大體來說,常見物種的組織細胞樣品當中,單個樣品中往往可以檢出數千到數萬種不同的 eccDNA。
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      樣品中 eccDNA 的數目及 eccDNA 上基因的數目
      圖來自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”

      eccDNA上的基因
      雖然在不同類型的樣品中存在一定的異質性,但大體來說,由于 eccDNA 長度普遍較短,多數 eccDNA 并不包含完整的基因序列。對于含有完整基因序列的 eccDNA,其中含有1個基因的最多,而含有2個、3個、4個基因的 eccDNA 則有依次遞減的趨勢。
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      eccDNA 上含有的基因個數的分布情況
      圖來自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”


      eccDNA在染色體上的分布特征
      大量文獻報道都發現,eccDNA 廣泛來源于各條染色體。在對于人類而言,基因密度高的 17、19 號染色體上的 eccDNA 密度也較高;而基因密度低的 X、Y 染色體上,eccDNA 密度則較低。
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      eccDNA 在人類染色體上的分布特征
      圖來自“Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue”

      eccDNA成環位點附近的motif特征
      雖然學界目前沒有公認的描述,但 eccDNA 成環位點附近的核酸序列是存在一定的規律特征的。有一些論文當中分析了成環位點附近的 motif 特征,從結果上來看,存在一定的相似性。關于 eccDNA 成環位點附近的 motif 特征的具體結論還有待未來的研究進一步闡明。
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      eccDNA 成環位點附近的 motif 特征
      上方圖來自“Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma”
      下方圖來自 “Circle-Seq reveals genomic and disease-specific hallmarks in urinary cell-free extrachromosomal circular DNAs”


      eccDNA的細胞內外的分布
      eccDNA 雖然主要分布于細胞核,但在細胞質中也有發現。此外,即使是在外泌體、血液、尿液等細胞外場所,也有 eccDNA 存在(往往是較小的環),這可能是因為 eccDNA 環狀結構相對穩定,在細胞外也不易被降解。

      eccDNA的形成
      eccDNA 的形成機制,至今仍然停留在假說階段,沒有通用的、公認的模型。目前的研究普遍認為,eccDNA 的形成與染色體DNA的損傷及修復密切相關,因此,具體的 eccDNA 形成機制取決于染色體 DNA 的損傷發生形式以及修復方法。下面介紹幾種主流的 eccDNA 形成機制的假說:
      1.雙鏈斷裂(DSBs)假說
      在同一條染色體上,如果發生兩處雙鏈斷裂,則脫落下來的一段 DNA 有可能在錯配修復(Mismatch repair,簡稱MMR)或非同源末端修復(Nonhomologous end joining,簡稱NHEJ)機制作用下成環。多個不同來源的 DNA 片段也有可能形成嵌合的環狀 DNA。支持這一假設的直接證據,有 2018 年發表在Nulceic Acid Research 上的這篇論文,通過 CRISPR 技術在同一染色體上人為制造兩處雙鏈斷裂,直接驗證了 eccDNA 可由雙鏈斷裂產生。

      2.染色體碎裂(Chromothripsis )假說
      在癌癥中,大規模的DNA損傷導致的染色體碎裂,可以作為 eccDNA 的一個來源。染色體碎裂涉及多個DNA雙鏈斷裂,將整條染色體碎片化。2020 年發表在 Nature 上的這篇論文認為,染色體碎裂是癌癥中 eccDNA 的主要來源。

      3.斷裂-融合-橋(breakage–fusion–bridge ,簡稱 BFB)假說
      “斷裂-融合-橋”循環始于一條染色體的雙鏈斷裂,使該染色體失去了一個端粒。缺乏端粒的染色體末端可以融合形成一個擁有兩個著絲粒的染色體。到了減數分裂后期,雙著絲粒染色體將會被拉開,形成染色體橋,隨后染色體橋斷裂,產生各種染色體畸變,這其中的產物就可能包括 eccDNA。雖然早期的研究者將 BFB 機制單列為一個 eccDNA 的產生機制,但近來的研究傾向于認為 BFB 可能是通過染色體碎裂來生成 eccDNA 的。
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      eccDNA 形成機制的三類假說
      圖來自“Extrachromosomal circular DNA in cancer: history, current knowledge, and methods”

      eccDNA的維持和分布
      1980年代的早期研究顯示,eccDNA 可能在每次有絲分裂周期中都會復制,但由于缺乏著絲粒,所以無法在有絲分裂中均勻分布到子細胞當中。因此,這種不均勻的 eccDNA 分配,將賦予一部分子細胞更強的生存和增殖能力,給癌癥的發展提供豐富的可能性。已有多篇文獻報道顯示,EGFR、MYC、MYCN 等腫瘤相關基因在腫瘤樣品以及抗藥性細胞樣品中的 eccDNA 上普遍存在。
      2022 年發表在 Cancer Discovery 上的這篇論文用一種名為 ecTag 的熒光技術標記了 eccDNA 的成環位點,從而可以觀察 eccDNA 的真實分布,為 eccDNA 在有絲分裂時的不均勻分配提供了直接的實驗證據。
      盡管如此,eccDNA 究竟是如何在細胞中維持復制的,至今仍然是一個很有爭議的問題。由于 eccDNA 大部分長度較短,其上很可能缺乏復制起點( Replication origin),無法進行 DNA 復制。目前,學界還不清楚這些 eccDNA 水平的提高是復制擴增的結果還是因為 eccDNA 生物生成水平的提升。

      eccDNA的定量分析
      目前,并無文獻報道使用 qPCR 的方式來測定 eccDNA 的含量。然而,通過全基因組測序(WGS)或單核苷酸多態性分析的芯片測試獲取到的拷貝數異變(CNV),可以間接反應 eccDNA 拷貝數的升高。

      eccDNA的已知功能
      eccDNA 的生物學功能是極其豐富的。目前已經明確的功能至少有以下這些類型:
      1.抗藥性:例如賦予植物的抗除草劑能力,或賦予腫瘤細胞以耐受化療藥的能力
      2.功能增強:例如,在肌肉當中,含有 TTN 基因的 eccDNA 的表達水平上升,可能可以表達更多的肌聯蛋白(titin)。
      3.衰老:在酵母、果蠅以及小鼠的研究中都有發現,eccDNA 隨著年齡的增加而積累;然而,在人類精細胞當中,eccDNA 的含量卻與年齡存在相反的關聯關系,在年輕樣品當中反而具有更高的 eccDNA 含量。因此,eccDNA 與衰老之間的關系還有待進一步研究和總結。
      4.維持基因組穩定性:有一類特殊的 eccDNA 具有維護端粒穩定性的功能,即“t-circle”。
      5.免疫功能:eccDNA 可能因為其彎曲的環狀空間結構(而非核酸序列特征),而起到激發先天免疫的作用。云序生物對此項研究進行過詳細解讀,點擊鏈接即可查看。
      6.細胞間通訊:由于 eccDNA 環狀結構的穩定性,所以 eccDNA 在血液、外泌體等細胞間結構中廣泛存在,有可能通過細胞再攝入而起到細胞間通訊的作用。
      可以想像,eccDNA 還有很多生物學功能待進一步發現和總結。

      eccDNA研究項目如何更上一層樓
      囿于目前研究手段的限制,我們并不能單獨對 eccDNA 進行類似于基因組 DNA 那樣的基因敲除/敲降處理,也難以針對單個的 eccDNA 進行過表達實驗。因此,eccDNA 的研究項目,在完成了 eccDNA 測序實驗后,確實難以進一步開展分子機制的研究。
      然而,我們還是有辦法在 eccDNA 譜的基礎上,更上一層樓做一些進階的研究的。常見的思路是多組學聯合分析,例如 eccDNA-mRNA 聯合分析、eccDNA-miRNA 聯合分析 、eccDNA-RNA m6A 修飾聯合分析、eccDNA-WGS 聯合分析等。
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      eccDNA-mRNA 聯合分析案例
      圖來自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”

      此外,針對 eccDNA 上的 5mC 甲基化修飾,我們還能開展環狀DNA甲基化測序, 在的提供 eccDNA 譜的基礎上額外實現單堿基精度的甲基化修飾檢測。該方案利用酶學方法實現 C 到 T 的溫和轉化,并保留 5mC 修飾的堿基不變,從而在 eccDNA 測序的基礎上額外給出 eccDNA 甲基化的數據,實現一箭雙雕的效果。
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      不同長度的 eccDNA 的相對豐都及甲基化修飾水平分布圖
      圖來自“Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance”

      此外,也有學者通過 eccDNA 結構疏松的特點,利用 ATAC-seq 技術實現了對 eccDNA 的檢測。該方案無需對 eccDNA 進行滾環擴增,可能有利于避免不同大小 eccDNA 滾環擴增效率不同所帶來的定量差異。
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      利用 ATAC-seq 技術實現對 eccDNA 的檢測
      圖來自“ATAC-Seq-based Identification of Extrachromosomal Circular DNA in Mammalian Cells and Its Validation Using Inverse PCR and FISH”

      無論如何,通過高通量測序實驗找出少數幾個感興趣的 eccDNA 后,我們還需要對其進行低通量的驗證實驗,以確保該 eccDNA 在樣品當中的真實存在。常見的 eccDNA 驗證實驗方法有針對成環位點的反式 qPCR(Inverse qPCR 或 Outward-facing qPCR)和Sanger 測序
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      通過 Sanger 測序和反式 PCR 驗證 eccDNA 成環位點的真實性
      圖來自“Encoding gene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA and contributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma via inducing autophagy”

      總之,雖然目前 eccDNA 的研究手段比較有限,但仍然可以結合其他實驗方法,拓展 eccDNA 研究項目的廣度。多組學聯合分析、eccDNA 自身的甲基化研究、eccDNA 驗證是目前常見的幾類拓展研究思路。

      云序生物eccDNA測序
      云序生物是國內最早提供環狀DNA測序服務的公司,早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年,云序率先發布了組織細胞環狀 DNA 測序(circle-seq),并成為A&A Bio獨家代理(該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用)。2020年,云序又相繼發布了體液樣品環狀DNA測序體液樣品環狀DNA甲基化測序,均為全國首發,并成為國內環狀DNA產品線最全的測序公司。迄今為止,我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序,積累了豐富的項目經驗,樣品類型涵蓋:組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等,物種涵蓋:人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年,云序生物的客戶率先發表國內首批 eccDNA 研究論文,其中更有發表于 Nature Communications 上的高分研究


      云序生物eccDNA相關產品

      組織細胞環狀 DNA 測序

      體液樣品環狀DNA 測序

      體液樣品環狀DNA 甲基化測序

      環狀DNA Sanger 測序驗證

      A&A Biotechnology 環狀DNA 純化柱


      1.組織細胞環狀DNA測序
      云序生物基于circle-seq的方法,采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號,高效地純化和富集環狀DNA,再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程,本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
      技術優勢:
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      云序生物eccDNA測序實驗示意圖

      2.體液樣品環狀DNA測序
      針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品,云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法,酶切去除線性DNA后,利用Tn5轉座酶,打開eccDNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭,進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高,損耗低,實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量,使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
      技術優勢:
      • 減少DNA損失
      • 保留原始表達量,不同環狀DNA間表達量比較更準確

      3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
      針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品,云序參考盧煜明教授團隊今年研發的方法,酶切去除線性DNA后,利用Tn5轉座酶,打開環狀DNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭,并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U,進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
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      技術優勢:
      一箭雙雕:同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況,節約樣品,性價比高
      單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析

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